Resumen La actividad cervecera en la Patagonia andina argentina tiene un rol muy importante en la economía de la región; una de las problemáticas que enfrenta, en términos de calidad, son las contaminaciones microbianas. La presencia de bacterias y levaduras contaminantes en la cerveza produce cambios microbiológicos, físicos y químicos, que impactan en sus atributos sensoriales. No obstante, pocas cervecerías establecen criterios y políticas que garanticen la calidad microbiológica de sus productos. El propósito de este trabajo fue estudiar por primera vez la incidencia de contaminantes microbianos en cervezas artesanales embotelladas producidas en la Patagonia andina argentina, además de identificar los principales microorganismos involucrados y determinar posibles relaciones entre los eventos de contaminación y variables fisicoquímicas de la cerveza. Para ello se analizaron 75 cervezas provenientes de 37 cervecerías de 12 localidades andinas. El 69,3% de las muestras analizadas evidenció crecimiento de microorganismos en los medios de cultivo empleados para la detección de contaminantes cerveceros. La bacteria Levilactobacillus brevis y levaduras del género Saccharomyces fueron los principales contaminantes identificados. Se comprobó que las contaminaciones microbianas impactaron sobre el perfil sensorial de la cerveza y que el cambio de pH fue un indicador de contaminación por bacterias lácticas. De cada 10 fábricas estudiadas, 8 presentaron problemas de contaminación, lo que pone en evidencia la necesidad de diseñar estrategias de prevención y control de contaminaciones en microcervecerías.

Abstract The brewing activity in Andean Patagonia plays a very important role in the region's economy, being microbial contamination one of the main problems in terms of quality. The presence of contaminant bacteria and wild yeasts in beer generate microbiological, physical and chemical changes that impact on its sensory attributes. However, few breweries establish criteria and policies to guarantee the quality of their products in a microbiological sense. The purpose of this work was to study for the first time the incidence of microbial contaminants in bottled craft beers from Andean Patagonia, identify the main microorganisms involved and establish relationships between contamination and the physicochemical variables of beer. We analyzed 75 beers from 37 breweries from 12 different Patagonian cities. Our results showed that 69.3% of the analyzed beer exhibited contaminant microorganism growth. Bacteria Levilactobacillus brevis and wild yeasts of Saccharomyces were the main microorganisms responsible for these contaminations. In addition, we found that microbial contamination had an impact on beer sensory profile and also that pH was correlated with the presence of lactic acid bacteria in beer, being an indicator of contamination for these bacteria. In conclusion, we observed that 8 out of 10 breweries studied showed contamination problems, highlighting the need to design prevention and control strategies in microbreweries.

Abstract Among the main beer components, fusel alcohols are important because of their influence on the flavor of the final product, and therefore on its quality. During the production process, these compounds are generated by yeasts through the metabolism of amino acids. The yeasts, fermentation conditions and wort composition affect fusel alcohols profiles and their concentrations. In this review, we provide detailed information about the enzymes involved in fusel alcohols formation and their regulation. Moreover, we describe how the type of yeast used, the fermentation temperature and the composition of carbohydrates and nitrogen source in wort, among other fermentation parameters, affect the biosynthesis of these alcohols. Knowing how fusel alcohol levels vary during beer production provides a relevant tool for brewers to achieve the desired characteristics in the final product and at the same time highlights the aspects still unknown to science.

Resumen Entre los principales componentes de la cerveza, los alcoholes superiores son de importancia por su influencia en el sabor y el aroma del producto final, y por ende, en su calidad. Durante el proceso de producción de cerveza, estos compuestos se generan por las levaduras a partir del metabolismo de aminoácidos. Tanto las levaduras como las condiciones de fermentación y la composición del mosto afectan el perfil de alcoholes superiores y sus concentraciones. En la presente revisión se reúne información detallada sobre las enzimas que participan en la formación de alcoholes superiores y su regulación. Además, se describe cómo el tipo de levadura utilizada, la temperatura de fermentación, la composición de hidratos de carbono y la fuente de nitrógeno presente en el mosto, entre otros parámetros de fermentación, afectan la biosíntesis de estos alcoholes. El análisis de los factores que afectan los niveles de alcoholes superiores durante la elaboración de la cerveza brinda a los productores cerveceros una herramienta de relevancia para lograr las características deseadas en el producto final, y al mismo tiempo, pone en evidencia aspectos aún desconocidos para la ciencia.

During brewing process yeast produce more than 500 chemical compounds that can negatively and positively impact beer at the organoleptic level. In recent years, and particularly thanks to the advancement of molecular biology and genomics, there has been considerable progress in our understanding about the molecular and cellular basis of the synthesis and regulation of many of these flavor compounds. This article focuses on esters, responsible for the floral and fruity beer flavor. Its formation depends on various enzymes and factors such as the concentration of wort nutrients, the amount of dissolved oxygen and carbon dioxide, fermentation temperature and mainly the genetics of the yeast used. We provide information about how the esters originate and how is the impact of different fermentative parameters on the final concentrations of these compounds and the quality of the end product.

Las levaduras, durante el proceso de elaboración de cerveza, producen más de 500 compuestos químicos; estos pueden impactar tanto negativa como positivamente en las características organolépticas de la cerveza. En los últimos años, y en particular gracias al avance de la biología molecular y la genómica, se han logrado progresos notables en el conocimiento de las bases moleculares y celulares de la síntesis y regulación de muchos de estos compuestos que inciden en lo que se denomina flavor (aroma y sabor) de la cerveza. Este artículo está enfocado en los ésteres responsables del aroma y el sabor floral y frutado de la cerveza. La formación de estos ésteres depende de diversas enzimas y de factores como la concentración de nutrientes presente en el mosto, la cantidad de oxígeno y dióxido de carbono disuelto, la temperatura de fermentación y, principalmente, la genética de la levadura utilizada. En esta revisión se brinda información de cómo se originan los ésteres y cómo los diferentes parámetros fermentativos impactan en las concentraciones finales de estos compuestos y en la calidad del producto terminado.

It has been recently found that the natural distribution, habitat, and genetic diversity of astaxanthin-producing yeasts (i.e. Phaffia rhodozyma, synonym Xanthophyllomyces dendrorhous) is much greater than previously thought. P. rhodozyma is biotechnologically exploited due to its ability to produce the carotenoid pigment astaxanthin and thus, it is used as a natural source of this pigment for aquaculture. P. rhodozyma was also capable of synthesizing the potent UVB sunscreen mycosporine-glutaminol-glucoside (MGG). Therefore, further environmental studies are needed to elucidate its ecological aspects and detect new potential strains for the production of astaxanthin and MGG. However, obtaining new isolates of P. rhodozyma and related species is not always easy due to its low abundance and the presence of other sympatric and pigmented yeasts. In this work we report a successful development of a species-specific primer which has the ability to quickly and accurately detecting isolates representing all known lineages of the genus Phaffia (including novel species of the genus) and excluding closely related taxa. For this purpose, a primer of 20 nucleotides (called PhR) was designed to be used in combination with universal primers ITS3 and NL4 in a multiplex amplification. The proposed method has the sensitivity and specificity required for the precise detection of new isolates, and therefore represents an important tool for the environmental search for novel astaxanthin-producing yeasts.

Recientemente, se ha encontrado que la distribución natural, el hábitat y la diversidad genética de levaduras productoras de astaxantina (p. ej., Phaffia rhodozyma, sinónimo Xanthophyllomyces dendrorhous) son mucho mayores de lo que se pensaba. P. rhodozyma se explota biotecnológicamente debido a su capacidad para producir el pigmento carotenoide astaxantina y, por lo tanto, se utiliza como una fuente natural de este pigmento para la acuicultura. También se encontró que esta levadura es capaz de sintetizar el potente protector solar UVB micosporina-glutaminol-glucósido (MGG). Por lo tanto, más estudios ambientales para dilucidar sus aspectos ecológicos y detectar nuevas cepas potenciales productoras de astaxantina y MGG son necesarios. Sin embargo, la obtención de nuevos aislamientos de P. rhodozyma y especies relacionadas no siempre es fácil debido a su baja abundancia y a la presencia de otras levaduras simpátricas y pigmentadas. En este trabajo se describe el desarrollo exitoso de un cebador especie-específico que tiene la capacidad de detectar rápidamente y con precisión cepas representativas de todos los linajes del género Phaffia previamente reportados (incluyendo nuevas especies del género) y excluir especies estrechamente relacionadas. Para ello, se diseñó un cebador de 20 nucleótidos (denominado PhR) para ser utilizado en combinación con los cebadores universales ITS3 y NL4 en una amplificación multiplex. El método propuesto tiene la sensibilidad y la especificidad requerida para la detección precisa de nuevos aislamientos y, por lo tanto, representa una importante herramienta para la búsqueda ambiental de nuevas levaduras productoras de astaxantina.

Comparison of techniques for isolation and enumeration of yeast and yeast like fungi from Nothofagus pumilio phylloplane. The phylloplane is an important habitat for microorganisms. This study aimed to test different methods for the isolation of yeasts and dimorphic fungi from the phylloplane of Nothofagus pumilio, the dominant tree species in Patagonia. The tested methods included printing on agar, vertical agitation on water, with the addition of surfactant compounds (Tween 80) or abrasive material (sand), maceration and ultrasound treatment. A method that combines the vertical agitation, with application of ultrasound was established as the most appropriated for the isolation and enumeration. With this method it was determined that the density of yeasts and dimorphic fungi in the phylloplane of N. pumilio ranged between 10 and 10³ colony forming units per cm², values between 10 and 100 times lower than those observed for other tree species. Also, the dimorphic fungi Aureobasidium pullulans was determined as the dominant fungal species in this environment.

El floplano es un importante hábitat de microorganismos. Este trabajo tuvo como objetivo probar distintos métodos para el aislamiento de levaduras y hongos dimórfcos del floplano de Nothofagus pumilio, la especie arbórea dominante de Patagonia. Los métodos probados fueron la impresión sobre medio sólido, agitación vertical con agua durante distintos tiempos, con la adición de surfactante (Tween 80) o abrasivos (arena); macerado y ultrasonido. Se estableció un método que combina la agitación vertical con la aplicación de ultrasonido como metodología apropiada para el aislamiento y recuento. Con este método se determinó que la densidad de levaduras y hongos dimórfcos en el floplano de N. pumilio osciló entre las 10 y 10³ unidades formadoras de colonias sobre cm², valores entre 10 y 100 veces inferiores a los observados para otras especies arbóreas. También se estableció al hongo dimórfco Aureobasidium pullulans como la especie dominante de este ambiente.

The occurrence and distribution of Xanthophyllomyces dendrorhous associated with Cyttaria hariotii parasitizing three Nothofagus species (N. dombeyi, N. antarctica and N. pumilio) in northwestern Patagonia (Argentina), as well as the factors that may affect this distribution were herein studied. Between 2000 and 2007, samples were obtained from 18 different locations. Based on physiological tests and morphological characteristics of sexual structures, 72 isolates were identified as X. dendrorhous. Representative strains were studied by MSP-PCR fingerprinting and sequence analysis of the ITS region. MSP-PCR fingerprints were similar for the newly isolated strains, and were also identical to the profiles of the strains previously found in this region. Patagonian strains appear to be a genetically uniform and distinct population, supporting the hypothesis that the association with different host species has determined genetically distinct X. dendrorhous populations worldwide. X. dendrorhous was recovered from N. dombeyi and N. antarctica. Approximately half the sampling sites and samples were positive for X. dendrorhous, but the isolation recovery rate was low. X. dendrorhous was absent in the early stages of ascostromata maturation, becoming more abundant in later stages. The present work represents a step forward in the understanding of the natural distribution and ecology of this biotechnologically relevant yeast.

Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) asociado a estromas de Cyttaria hariotii en bosques de Nothofagus en el noroeste de la Patagonia. Se estudió la ocurrencia y la distribución de Xanthophyllomyces dendrorhous asociado a Cyttaria hariotii en tres especies de Nothofagus (N. dombeyi, N. antarctica y N. pumilio) del noroeste de la Patagonia (Argentina), y los factores que podrían afectar esta distribución. El muestreo se realizó entre 2000 y 2007 en 18 sitios diferentes. Según las pruebas fisiológicas y las características morfológicas de las estructuras sexuales, 72 de los aislamientos obtenidos se identificaron como X. dendrorhous. Se estudiaron cepas representativas mediante la técnica de MSP-PCR fingerprinting y secuenciación de la región ITS. Los perfiles de MSP-PCR fueron similares, tanto entre los nuevos aislamientos como entre estos y los de cepas previamente obtenidas en la región. Aparentemente, las cepas patagónicas forman una población genéticamente uniforme y distinta de otras poblaciones. Esto apoya la hipótesis de que la asociación con diferentes especies hospedadoras ha determinado la diferenciación genética de X. dendrorhous en todo el mundo. X. dendrorhous se recuperó de N. dombeyi y de N. antarctica. Aproximadamente la mitad de los sitios de muestreo y de muestras fueron positivos para X. dendrorhous, pero la tasa de aislamiento fue muy baja. X. dendrorhous está ausente en estadios tempranos de maduración de ascostromas y se hace más abundante en estadios más tardíos. El presente trabajo contribuye al mejor entendimiento de la distribución natural y la ecología de esta levadura, de relevancia biotecnológica.

The diversity of yeasts collected from different sites in Antarctica (Admiralty Bay, King George Island and Port Foster Bay and Deception Island) and their ability to produce extracellular enzymes and mycosporines were studied. Samples were collected during the austral summer season, between November 2006 and January 2007, from the rhizosphere of Deschampsia antarctica, ornithogenic (penguin guano) soil, soil, marine and lake sediments, marine water and freshwater from lakes. A total of 89 isolates belonging to the following genera were recovered: Bensingtonia, Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Dioszegia, Exophiala, Filobasidium, Issatchenkia (Pichia), Kodamaea, Leucosporidium, Leucosporidiella, Metschnikowia, Nadsonia, Pichia, Rhodotorula, and Sporidiobolus, and the yeast-like fungi Aureobasidium, Leuconeurospora and Microglossum. Cryptococcus victoriae was the most frequently identified species. Several species isolated in our study have been previously reported to be Antarctic psychophilic yeasts, including Cr. antarcticus, Cr. victoriae, Dioszegia hungarica and Leucosporidium scottii. The cosmopolitan yeast species A. pullulans, C. zeylanoides, D. hansenii, I. orientalis, K. ohmeri, P. guilliermondii, Rh. mucilaginosa, and S. salmonicolor were also isolated. Five possible new species were identified. Sixty percent of the yeasts had at least one detectable extracellular enzymatic activity. Cryptococcus antarcticus, D. aurantiaca, D. crocea, D. hungarica, Dioszegia sp., E. xenobiotica, Rh. glaciales, Rh. laryngis, Microglossum sp. 1 and Microglossum sp. 2 produced mycosporines. Of the yeast isolates, 41.7% produced pigments and/or mycosporines and could be considered adapted to survive in Antarctica. Most of the yeasts had extracellular enzymatic activities at 4ºC and 20ºC, indicating that they could be metabolically active in the sampled substrates.

Yeasts have been associated with mankind from early ages. Among these, fermentative yeasts played the most relevant role, due to its importance in the food industry. The biotechnological implications of these yeasts have been extensively studied. However there is a lack of information about its distribution in nature and ecology. In this study samples of Cyttaria hariotii, ascomycete fungus parasite of trees of the genus Nothofagus, were collected in Nahuel Huapi National Park (Northwestern Patagonia, Argentina). 72 isolates were obtained using a selective culture medium with 8% ethanol. Identification of the isolates was based on morphological and physiological tests, and then sorted into five groups. Three groups were assigned to the genera Saccharomyces, Pichia and Kloeckera respectively. The Saccharomyces group was the prevailing one, and was sorted into three subgroups. Two of them were related to S. bayanus and /or S. uvarum. All the isolates were psychrotolerant and the maximum growth temperature ranged between 35 and 37 _C. This work contributes to the knowledge of the biodiversity of yeasts in the region and represents the first massive isolation of Saccharomyces yeasts in natural environments of Patagonia.

Las levaduras han estado asociadas al hombre desde épocas muy tempranas. Entre estas se destacan las fermentadoras debido a su importancia en la industria de los alimentos. Las implicancias biotecnológicas de estas levaduras han sido extensamente estudiadas, sin embargo la distribución en la naturaleza y la ecología de estas no se encuentra igualmente documentada. El presente estudio se realizó en el Parque Nacional Nahuel Huapi (Noroeste Patagónico, Argentina) sobre Cyttaria hariotii, hongo ascomicético parásito de árboles del género Nothofagus. Mediante el uso de un medio selectivo con etanol 8 % se obtuvieron 72 aislamientos. Los mismos fueron ordenados en cinco grupos en base a pruebas morfológicas y fisiológicas, tres de los cuales fueron asignados a los géneros Saccharomyces, Pichia y Kloeckera. El grupo Saccharomyces presentó el mayor número de aislamientos y se subdividió en tres subgrupos, dos de ellos presentan alta afinidad con S. bayanus y/ó S. uvarum. La totalidad de los aislamientos fueron psicrotolerantes y la temperatura máxima de crecimiento osciló entre 35 y 37 _C. El presente trabajo contribuye al conocimiento de la biodiversidad de levaduras de la Patagonia y representa el primer aislamiento masivo de levaduras sacaromicéticas en ambientes naturales de la región.

This research proposes the use of culture medium added with 25 >g/mL of Rose Bengal and 200 >g/mL of Chloramphenicol. Under these culture conditions the yeast counts were about 10³ CFU/g of soil (approximately 4% of detected microflora). Isolation with and without a previous enrichment step was compared. Isolated yeasts were classified into 7 groups based on morphological and physiological characteristics. 10 different banding patterns were observed using MSP-PCR technique, which indicate the presences of at least 10 species. Different banding pattern was observed between cultures with and without enrichment, this revealed the need of using both isolation techniques in a complementary way to recover strains inhibited or underestimated by direct non-enrichment methods.

Se compararon las condiciones de cultivo para aislar y contar levaduras del suelo de los bosques nativos de Nothofagus spp. en la Patagonia de Argentina. En este trabajo se propone la utilización de medios de cultivo adicionados con Rosa de Bengala 25 >g/mL y 200 >g/mL de Cloranfenicol. En estas condiciones se obtuvieron recuentos de levaduras que rondan 10³ UFC/g de suelo (aproximadamente 4% de la flora microbiana detectada). Se compararon los resultados de aislamientos por el método enriquecimiento-remoción utilizando las condiciones sin-enriquecimiento y con-enriquecimiento. Las levaduras aisladas fueron clasificadas en 7 grupos por características morfológicas y fisiológicas. Utilizando la técnica de MSP-PCR se obtuvieron 10 perfiles de bandas diferentes, que indicarían la presencia de al menos 10 especies en el suelo. La obtención de perfiles de bandas diferentes en los ensayos sin-enriquecimiento y con-enriquecimiento revelan la necesidad de utilizar estas dos formas de cultivo de manera complementaria para la recuperación de otras cepas, inhibidas o subestimadas por el cultivo directo sin-enriquecimiento.

Yeast biodiversity at the acid aquatic environment of the Agrio River and Caviahue Lake was studied. All water samples analyzed contained yeasts in variable concentrations (25 - 1192 UFC L-1). 202 yeasts strains were isolated and on the basis of morphological and physiological studies were assigned to five genera: Candida, Cryptococcus, Cystofilobasidium, Rhodotorula and Sporobolomyces. Cryptococcus and Rhodotorula were the most abundant genera, comprising the 98% of the isolated yeast strains. The results of the tests mentioned above suggested the existence of at least eighteen different yeast species. This work provides the first quantitative and qualitative data on yeasts from an aquatic acid environment of natural origin in Argentina.

Se estudió la biodiversidad de levaduras presente en el ambiente acuático ácido del Río Agrio y el Lago Caviahue. En todas las muestras de agua analizadas se encontraron levaduras en concentraciones variables (25 - 1192 UFC L-1). Fueron aisladas un total de 202 cepas de levaduras, las cuales en base a estudios morfológicos y fisiológicos fueron asignadas a cinco géneros: Candida, Cryptococcus, Cystofilobasidium, Rhodotorula y Sporobolomyces. Los géneros Cryptococcus y Rhodotorula fueron los más abundantes, correspondiendo ambos al 98% del total de las levaduras aisladas. Asimismo, los resultados de las pruebas antes mencionadas sugieren la existencia de al menos dieciocho especies. Este trabajo representa el primer registro cuantitativo y cualitativo de levaduras de un ambiente acuático ácido de origen natural de la Argentina.